立体構造の制限により多剤排出アダプタータンパク質の阻害が形成される

Nature Communications volume 14、記事番号: 3900 (2023) この記事を引用

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膜排出ポンプは細菌の多剤耐性において主要な役割を果たします。 大腸菌由来の三部構成の多剤排出ポンプ システムである AcrAB-TolC は、他の ESKAPE 病原体のホモログと同様に、耐性の発現を軽減し、抗生物質の有効性を回復するための阻害の標的です。 今回我々は、水素/重水素交換質量分析法、細胞流出アッセイ、分子動力学シミュレーションを組み合わせて、ペリプラズムアダプタータンパク質AcrAに対する阻害機構を合理化する。 我々は、AcrA の構造動力学を定義し、阻害剤がその 4 つのドメインすべてにわたって長距離の安定化をもたらすことができるのに対し、相互作用する流出基質の効果は最小限であることを発見しました。 我々の結果は、阻害剤がAcrAのリポイルとαβバレルドメインの間の裂け目内に分子くさびを形成し、AcrBからTolCへの薬物誘発シグナルの立体構造伝達を減少させるというモデルを裏付ける。 この研究は、抗菌治療薬の開発に役立つ可能性のある多剤アダプタータンパク質の機能についての分子的洞察を提供します。

多剤耐性とは、構造的に多様な多くの化合物からの致死量に耐える細菌性病原体の能力を指します1。 細菌の多剤耐性は驚くべき速度で広がり続けており、世界中で人間の健康を脅かしています。 2019 年には、細菌の多剤耐性が直接の原因となり、世界中で 127 万人の死亡者が発生しました。これは、HIV とマラリアを合わせた数を上回っています2。

多剤耐性の主なメカニズムは排出ポンプの活性です3,4。 排出ポンプは一般に抗生物質への曝露に反応して過剰発現し、化学的に多様な化合物を広範囲に輸送し、細胞内の抗生物質濃度を低下させ、薬剤耐性を与える可能性があります1。 疎水性両親媒性耐性結節形成および細胞分裂 (HAE-RND) ファミリーのトランスポーターは、細菌の多剤耐性において重要な役割を果たしています。 大腸菌 AcrAB-TolC は、他のグラム陰性菌 ESKAPE 細菌の相同体を持つこのファミリーの典型的なメンバーです 5、6、7。 これは、グラム陰性菌の膜エンベロープにまたがる三部構成のタンパク質複合体であり、AcrB は複合体の内膜トランスポーター、AcrA は膜融合タンパク質 (MFP) ファミリーのタンパク質のペリプラズムアダプタータンパク質 (PAP)、および TolC です。外膜チャネル（図1a）。 プロトン推進力によってエネルギーを与えられたAcrBは、AcrAとTolCによって形成された密閉チャネルを介して、抗生物質を含む基質を細胞内環境から細胞外に輸送します（図1a）8、9。

細胞エンベロープに埋め込まれたAcrAB-TolC複合体の概略図。 LPSリポ多糖。 b AcrAB-TolC 複合体全体から単離された AcrA の構造 (PDB:5O66)23。 c AcrA の 3 つの構築物。 AcrAL には、シグナルペプチド 1-24 切断後に脂質化される Cys25 が含まれています。 AcrAS には Cys25Met 変異が含まれているため、脂質付加とシグナルペプチドが欠如しています。 AcrASD には、TRRIT リンカーによって接続された 2 つの AcrAS 配列が含まれています。 d pH 6.0でのAcrAコンストラクトのネイティブMS特性評価。 MSの前に、タンパク質緩衝液を100 mM酢酸アンモニウム緩衝液に交換した。 AcrAL では、2 × 臨界ミセル濃度 (CMC) の 0.03% の DDM の存在が必要でした。 AcrAL はモノマーとダイマーの混合物として存在し、AcrAS はモノマーとして、AcrASD はダイマーとして存在します。 生物学的複製および 2 つの異なるネイティブ MS システム (飛行時間型システムとオービトラップ システム) によって収集されたスペクトルにより、これらのスペクトル シグネチャがタンパク質の調製や MS 検出によるアーチファクトではないという確信が得られます 67。 アスタリスク (*) の付いたエンベロープは、固有の障害を示すより高い電荷状態を表します。 質量は補足表 1 にあります。

これらのシステムに対して、細菌集団が耐性となったさまざまな既存の抗生物質の活性を「復活」させる排出ポンプ阻害剤（EPI）を開発する努力がなされてきました10。 これまでは、AcrB トランスポーター自体をターゲットとする EPI を生成することに重点が置かれてきました。 しかし、以前に同定された EPI は、毒性の問題と、阻害剤を輸送する AcrB の無差別な性質のため、臨床試験に進むことができませんでした 11,12。 したがって、AcrA が阻害の潜在的な標的として浮上しており、成功する EPI を生成するためには他の手段を模索する必要があります 10,13。 最近、NSC 60339 は実験と計算を組み合わせたスクリーニングにより AcrA 阻害剤として同定されました 10。 以前の研究では、NSC 60339がAcrAの構造変化を引き起こす可能性が示唆され、サイトIVと呼ばれるリポイルとαβバレルドメイン間の界面に結合部位の可能性があることが提案されました（図1b）10、14。 さらに、AcrA は最近、より多様な機能を持つことが示され、大腸菌群内の細菌の「壊死シグナル」として同定されています 15: 群れの部分集団が死ぬと、死んだ細胞は壊死シグナル AcrA を放出し、これが他の細胞群の外側で TolC に結合します。生細胞、患部内の排出の刺激、およびさまざまな排出ポンプの上方制御16。 興味深いことに、最近の研究では、NSC 60339 が AcrA を介した壊死シグナル伝達能力を阻害できることも示されています 16。 したがって、AcrA 阻害の分子機構を理解することは、将来の EPI およびネクロシグナリング創薬にとって重要です。 しかし、AcrA 阻害のメカニズムは依然として解明されていません。